real time PCR چیست؟ روش های انجام + کاربردها + مزایا

در مطلب قبلی در مورد پپتید و روش های سنتز آن صحبت کردیم. در این مطلب از دایا اکسیر که می توانید به راحتی خرید آنلاین مواد شیمیایی آزمایشگاهی را انجام دهید، می خواهیم درباره روش real time PCR به طور مفصل صحبت کنیم. خواهیم گفت تکنیک های انجام این روش به چه شکل است و این تکنیک چه کاربردها و مزیتی دارد؛ پس تا پایان همراه ما باشید.

real time PCR چیست؟

real time PCR مشاهده لحظه به لحظه یک فرآیند است؛ در این سیستم تشخیص یک ماده فلورسانت، درطی واکنش متناسب با میزان محصولات هر سیکل آزاد می شود ومیزان فلورسنت آن توسط یک نمایانگر (Detector) شناسایی و ثبت می گردد.

تکنیک های انجام PCR با استفاده از Real Time PCR

به طور کلی ۲ روش با استفاده از real time PCR وجود دارد:

• استفاده از DNA-binding agentهایی مثل SYBR green

با اضافه کردن رنگی به نام SYBR green به مخلوط PCR و با متصل شدن این رنگ به DNA، باعث ایجاد دو رشته ای همراه با سیگنال فلوئورسنت انجام می شود. همچنین کل DNA های دورشته‌ای موجود در هر زمان را گزارش می دهد. یکی از معایبی این روش، نتایج اتصال دو رشته هایی مثل پرایمر دایمر و دیگر باندهای غیراختصاصی را بیشتر از غلظت اصلی برآورد می کند که برای حل آن باید از آنالیز منحنی ذوب استفاده شود.

• استفاده از پروب گزارشگری

این روش انجام PCR با استفاده از real time PCR خود به ۲ دسته تقسیم می شود:

• Hydrolysis Probes

در استفاده از این روش، پروبها طوری طراحی می شوند که درابتدای پروب یک رنگ فلورسانس به نام Reporter و در انتهای آن فلورانسی دیگر به نام Quencher قرار میگیرد؛ زمانی که این دو در فاصله نزدیکی مولکولی از هم قرار می گیرند نوری که به Reporter می خورد باعث ایجاد یک تابش می شود که Quencher با جذب این نور، تابشی با طول موج بلندتر را ساطع کرده که توسط دستگاه قابل ارزیابی نیست. پس از جدایی این دوازهم، دیگر نور ساطع شده از Reporter توسط Quencher قابل جذب نیست و اینکار توسط دستگاه به صورت فلورانس اندازه گیری می شود. برای انجام این تکنیک از سه پروب  به نام های Taq man Probe، Beacons و Scorpions استفاده می شود.

• Hybridization Probes

در این روش، پروب ها در دو قطعه مختلف تشکیل می شوند یعنی فلورسانت یکی در انتهای ۵’ رشته الیگونوکلئوتیدی و دیگری در انتهای  ۳’ قرار میگیرد؛ زمانی که این دو ماده به محل مورد نظر خود بچسبند در نزدیکی این دو، واکنشی به نام  FRET ایجاد می شود. انتخاب رنگ در این مرحله با ساطع شدن طول موج از یکی به عنوان محرک بعدی نیز مورد استفاده قرار می گیرد. بعد از چسبیدن این دو پروب، رنگ ها نیز به هم نزدیک و فلورسانس ساطع شده اندازه گیری می شود. این نکته هم بدانید که در صورت تفاوت در یک نوکلوئیتید DNA، پروب ها به جایگاه خود متصل نمی شوند.

مزایای روش real time PCR

• قابل مشاهده بودن تکثیر در هر زمان؛ به عبارتی فراهم آوردن مانیتورینگ لحظه به لحظه واکنش و امکان بررسی فرآیند تکثیر در هر سیکل.
• قطع واکنش در هر زمان دلخواه بخاطر قابل مشاهده بودن روند PCR؛ با این ویژگی میتوان به واکنش در صورت رفتن به حالت سکون یا عدم تکثیر خاتمه و از اتلاف وقت و هزینه صرفه جویی کرد.
• قابل اندازه گیری بودن میزان دقیق و نسبی الگوی اولیه با دارا بودن روش های Absolute Quantification و Quantification Relative
• نیاز به زمان کم به دلیل بالا بودن انجام سرعت واکنش ها
• بالا بودن محدوده تشخیص آن نسبت به روش PCR  معمولی.

کاربردهای مهم روش real time PCR

• بررسی ژنها بخصوص در مورد بیماری های خود ایمنی و پاتوژنهایی نظیر لیشمانیا.
• بررسی میزان آنزیم های کبدی برای متابولیز کردن داروی خاص
• شناسایی و تعیین Load عوامل عفونی به خصوص در تعیین دقیق عواملی چون HBV وHIV برای درمان افراد آلوده
• یک روش قوی برای کنترل و مقایسه میزان آلودگی میکروبی در غذا و دارو
• بررسی سرطان های خونی و تعیین ریسک بازگشت آن در قبل، حین و بعد از مراحل درمان
• تعیین میزان موفقیت پیوند اعضا افراد با شاخص های ایمونولوژیک های ویژه
• تعیین دوز وکتور حاوی ژن مورد نظر در ژن درمانی و ارزیابی آن در هنگام ورود به سلولها یا بافت ها
• تشخیص ناقلین ناهنجاری های کروموزومی مثل سندرم داون و دوشن
• تشخیص قبل از تولد و لانه گزینی ، تعیین subtype ویروسها و باکتریها در ژنوتایپینگ
• پی بردن به وجود یا عدم وجود نقص در LOH از طریق تعیین شمارش های کپی ژن مورد نظر
• تشخیص در جهش های نقطه ای در منطقه ای از ژن یا همان SNP

آشنایی با روش های تعیین کمی مقدار ژن در real time PCR

گفتیم که یکی از مهم ترین کاربردهای این روش، تعیین کمی مقدار ژن است که با دو روش Absolute Quantification  و Relative Quantification انجام می گیرد. این یعنی چه؟ در واقع Absolute Quantification تعداد دقیق کپی از یک ژن را مشخص می کند که برای انجام اینکار نیاز به یک منحنی استاندارد دارد اما این در حالیست که از Relative Quantification برای نسبت یک ژن به ژن دیگر یا تغییرات کمی در بیان یک ژن مورد استفاده قرار میگیرد.

سخن پایانی

real time PCR یکی تکنیک برای بررسی کمی ژن ها و نوعی از آزمایش PCR استاندارد است بررسی میزان محصولات تولید شده همزمان با انجام فرآیند صورت می گرد که برای انجام کار خود از رنگ های فلورسنت مانند SYBR Green یا پروب های DNA حاوی فلوروفور مانند TaqMan در اندازه گیری میزان محصول تقویت شده هنگام زمان واقعی استفاده می کند.