در مطلب قبلی در مورد Immunoprecipitation (ایمونو پرسی پتاسیون) صحبت کردیم. در این مطلب از دایا اکسیر که می توانید به راحتی خرید آنلاین مواد شیمیایی آزمایشگاهی را انجام دهید، می خواهیم درباره یکی از تکنیک های موثر در زیست شناسی مولکولی به نام PCR صحبت کنیم. می خواهیم بدانیم PCR چیست و چه مراحلی برای انجم فرآیند آن وجود دارد، کاربردهای آن چگونه است و مهمترین انواع این روش کدام اند؟

PCR چیست؟

PCR چیست؟ | دایا اکسیر

Polymerase Chain Reaction، یک تکنیک برای ساخت میلیون ها کپی از قطعه DNA است یعنی یک واکنش زنجیره ای پلیمراز با گرم و سرد کردن مداوم یک قطعه DNA همراه با یک DNA پلیمراز قوی در برابر حرارت و دو توالی ویژه DNA به عنوان آغازگر در تکثیر یک بخش کوچک اختصاصی از ژنوم.

مراحل انجام PCR

به طورکلی آزمایشات این تکنیک در ۳ مرحله اصلی به نام های دناتوراسیون (Denaturation)، اتصال و گسترش صورت می پذیرد.

در مرحله Denaturation، پیوندهای هیدروژنی بین جفت بازهای DNA دو رشته  در دمای حدود ۸۹ درجه سانتی گراد از هم جدا و هر رشته از DNA  اولیه، به عنوان الگوی ساخت یک رشته مکمل مورد استفاده قرار میگیرد. این مرحله تکثیرکه براساس توانایی نوکلئوتید ها برای جفت شدن با باز مقابل خود،طبق قانون واتسون-کریک استوار است، باعث تعیین توالی بازی رشته مقابل می گردد.

در مرحله اتصال، با پایین آوردن دما تا ۲۷ الی ۹۴ درجه سانتی گراد، پرایمرهای الیگو نوکلئوتیدی اختصاصی براساس قوانین کلی جفت شدن بازها، متصل به رشته DNA الگو شده و ناحیه مورد نظر از DNA الگو را جهت تکثیر مشخص و نهایتا DNA  پلیمراز با اضافه کردن دی اکسی نوکلئوتیدها بر روی عامل  OH پرایمرها، مولکولهای جدیدی را  از روی هر دو رشته  در امتداد هم قرار می دهد. در تمامی طی این مراحل یک  پلیمراز مقاوم به DNA به نام Taq  فعال بوده تا به محض اتصال پرایمرها به DNA الگو، افزایش طول آنها آغاز شود.

نهایتا در مرحله سوم و گسترش، واکنش تا رسیدن به دمای بهینه فعالیت آنزیم پل مراز که در حدود ۲۷ درجه می باشد، افزایش یافته و در اولین چرخه به ازای هر رشته الگو، یک DNA دو رشته ای جدید ایجاد می شود. به این ترتیب تعداد نسخه های ناحیه هدف ۷ برابر  و به همین صورت در هر چرخه، تعداد نسخه های رشته  DNA هدف ، اضافه می شود.

کاربردهای قوی PCR

کاربردهای قوی PCR | دایا اکسیر

PCR در بیولوژی مولکولی و تمامی آزمایشگاه های تحقیقاتی زیست شناسی و تشخیص بیماری های خاص ژنتیکی در آزمایشگاه های ژنتیک، تشخیص سرطان و تشخیص بیماریهایی که در آنها سرعت و دقت نقش مهمی دارند، کاربرد فراوانی دارد. همچنین در تشخیص انواع بیماریهای انسان و دام شامل دامهای بزرگ، طیور و حتی آبزیان در اغلب  آزمایشگاه های تشخیص طبی نیزاز این تکنیک استفاده می کنند.

انواع واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)

  • Multiplex-PCR

اگر بخواهید چندین جایگاه ژنی را با استفاده از این روش انجام دهید باید از پرایمرهای مختلف و چندین جفت پرایمر اختصاصی برای تکثیر استفاده کنید چراکه این روش تنها یک جایگاه ژنی را بررسی می کند. از این روش بیشتر برای جستجو در بخش بزرگ یک DNA، آزمایش های بخش های غیرمرتبط به هم در یک ژنوم، جستجو موارد مختلف مثل شناسایی مننژیت با استفاده از پرایمرهای مختلف و به طور کلی برای شناسایی جایگاهی از ژن که جهش های زیادی در آن به وقوع پیوسته، استفاده می شود.

  • RT-PCR

ماده اولیه در این روش RNA می باشد که تبدیل به DNA توسط آنزیم نسخه بردار معکوس می شود. اما اگر این سوال در ذهن شما ایجاد شده که نتیجه برخی از موجودات مثل ویروس های دارای RNA که به جز آن هیچ ژنومی دیگر ندارند یا ویروس هپاتیت B که در اثر آنزیم نسخه بردار معکس تبدیل به DNA نمی شود، چیست باید گفت این روش با استفاده از آنزیم های نسخه بردار معکوس MMLV و AMV کار خود را انجام می دهد.

  • Real-Time PCR

این روش که از کاوشگرها یا هیبریداسیون نشان‌دار شده با رنگ‌های فلورسانس استفاده می کند بخاطر ترموسایکلرهایی که با سیستم فلورومتری در زمان جمع شدن پایش پیوسته خاصیت فلوئورسانس محصول  PCR بود، ایجاد شد تا پایش پیوسته محصول Polymerase Chain Reaction در روش الکتروفورز ژل آگاروز را بدون جداسازی آنها بدهد. این روش از سرعت بالاتری نسبت  به روش PCR معمولی بخاطر حذف مرحله Post-PCR، کاهش زمان سیکل‌های Polymerase Chain Reaction، روش‌های حساس آشکارسازی تابشی آن و نشانگرهای فلوروژنیک دارد اما دارای معایبی هم می باشد که از اصلی ترین آن میتوان به عدم توانایی در مشخص کردن اندازه محصول بدون بازکردن سیستم دانست.

  • Nested-PCR

این روش که از دوجفت پرایمر استفاده میکند به دلیل بالا بودن حسایت، کم بودن نیاز به کاوش و تاییدها بعدی و رقیق شدن ممانعت کننده ها به هنگاام انتقال محصول PCR به لوله جدید، نقش بسزایی در تشخیص جنین های مبتلا به سندروم داون و ویروس کودکان مبتلا به ناشنوایان ۱ درصد داشته است. در واقع این روش تاثیر بساری در تشخیص بیماری های وابسته به جنین دارد.

سخن پایانی

PCR تکنیکی است که می تواند نسخه های زیادی از یک ناحیه خاص DNA را در شرایط آزمایشگاهی (در لوله آزمایش) تهیه کند که افزایش تعداد نسخه آن به کمک آنزیم Taq polymerase صورت و انتخاب تعداد نسخه ها نیز به کمک primers ها صورت می گیرد. واکنش به طور مکرر از طریق یک سری تغییرات درجه حرارت به صورت چرخه ای اجرا شده و اجازه می دهد تا کپی های زیادی از ناحیه مورد نظر تولید شود.

همچنین از مهم ترین و پرکاربردترین PCRها در زمینه تحقیق و تشخیص میتوان به Multiplex Polymerase Chain Reaction،  Hot start Polymerase Chain Reaction،Touch down Polymerase Chain Reaction، Tetra –arms Polymerase Chain Reaction، Nested Polymerase Chain Reactionو GAP PCR دانست.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.