Immunoprecipitation (ایمونو پرسی پتاسیون) چیست؟ + روش های انجام آن

در مطلب قبلی در مورد باکتریوفاژ صحبت کردیم. در این مطلب از دایا اکسیر که می توانید به راحتی خرید آنلاین مواد شیمیایی آزمایشگاهی را انجام دهید، می خواهیم موضوع Immunoprecipitation (ایمونو پرسی پتاسیون) را بررسی کنیم. Immunoprecipitation  راجع به یک روش رایج در جداسازی پروتئین و سایر مولکول های زیستی از باقی مانده تجزیه سلولی یا بافتی است.

Immunoprecipitation (ایمونو پرسی پتاسیون) چیست؟

Immunoprecipitation، تکنیکی است که بر اساس تعامل آنتی بادی و آنتی ژن برای غنی سازی یا جداسازی پروتئین از نمونه های بیولوژیکی در مطالعه هویت، ساختار، بیان و تغییرات پس از ترجمه استفاده می شود. همچنین از تغییرات IP برای مطالعه تعامل بین پروتئین هدف با سایر پروتئین ها مثلا کروماتین از طریق Immunoprecipitation یا RNA-IP یا اسیدهای  نوکلئیک  از طریق Co-IP استفاده می شود.

پس هرگاه یک آنتی ژن محلول را در حضور آنتی بادی اختصاصی آن در محیط مایع یا نیمه جامد مانند آگار قرار دهیم مولکول ها این دو پس از رسیدن به هم و تشکیل کمپلکس، واکنش رسوبی ایمنی یا ایمونو پرسی پتاسیون (Immunoprecipitation) ایجاد
می کنند.

به بیانی ساده تر میتوان گفت در ایمونودیفوزیون، مولکول های آنتی ژن یا آنتی بادی طی روند انتشار ساده در داخل یک بستر انتخابی مثل محیط آبکی یا داخل ژل آگارز به حرکت در می آیند و اگر مواردی که بیان کردیم به صورت اختصاصی باشند در محل برخورد، کمپلکسی تشکیل می شود که غیر محلول است؛ بنابراین به واکنش ایجاد شده ایمونوپرسی پیتاسیون و به کمپلکس های تشکیل شده آن خطوط یا باند های رسوبی گفته می شود. در نهایت این باند های رسوبی معمولا در داخل بستر انتخابی و در محل بروز این اتفاق، بدون حرکت باقی می مانند.

روش های انجام Immunoprecipitation

براساس اینکه در ژل فقط یکی از مولکول ها (آنتی ژن یا آنتی بادی) یا هردو مولکول به طرف یکدیگر انتشار پیدا کنند دو روش وجود دارد:

• انتشار یک طرفه شعاعی (SRID) یا روش Mancini

Single Radial Immuno Diffusion، روش اول انجام Immunoprecipitation است که یک آزمایش کمی می باشد که در آن یکی از دو مولکول آنتی ژن یا آنتی بادی را در آگار مخلوط و ثابت می گیرند. از طرفی مولکول دیگری را که در حفره آگارایجاد کرده اند، می ریزند. مولکول داخل حفره با انتشار و نفوذ شعاعی در آگار، به ناحیه تعادل رسیده و با مولکول دیگر واکنش می کند. بنابراین فقط یکی از مولکول ها به صورت شعاعی در آگار نفوذ می کند.

در این روش یک خط رسوبی به صورت حلقه ای در حفره ایجاد شده که با ماده مجهول یعنی آنتی ژن یا آنتی بادی، متناسب است . حال با استفاده از اندازه گیری و مقایسه آن با منحنی، مقدار ماده مجهول (آنتی ژن یا آنتی بادی) به دست می آید. این هم لازم است بدانید که معمولا از این روش در اندازه گیری ایمونوگلوبولین های سرم و اجزا کمپلمان مانند اندازه گیری غلظت پروتئین هایی نظیرIgG،  IgA و IgG و پروتئین هایی مثل C4 ،  C3و فاکتورB بهره می برند.

• انتشار دو طرفه (DID) یا روش Ochtroloni

Double Immuno Diffusion، روش دوم انجام Immunoprecipitation است که یک تست کیفی است که بر اساس نفوذ هر دو مولکول آنتی ژن و آنتی بادی در آگار استوار است. هنگامی که این دو مولکول را جداگانه در دو حفره مقابل هم در آگار بریزیم، دو مولکول با انتشار شعاعی در همه جهات در آگار نفوذ و سه حالت ایجاد می کند.

• Identity: مشابه بودن دو آنتی ژن باهم
• Partial Identity: مشترک بودن یک یا چند اپی دو آنتی ژن باهم
• Non-Identity: متفاوت بودن دو آنتی ژن باهم

در این روش  نیمه کمی که در محیط نیمه جامد انجام می شود مبنا، حرکت آنتی ژن و آنتی بادی اختصاصی به طرف هم و ایجاد رسوبی ثابت و بدون حرکت ناشی از تشکیل کمپلکس آنتی ژن و آنتی بادی در بستر ژلی است.

این روش برای مقایسه اپی توپ آنتی ژن های نامعلوم با یکدیگر است؛ یعنی اگر دو آنتی ژن مصرفی از نظر اپی توپ ها با هم مشابه یا نیمه مشابه و یا غیر مشابه باشند شکل خطوط رسوبی آن ها با هم متفاوت خواهد بود. از این روش نیز در تعیین حضور آنتی ژن ، بررسی تشابه یا عدم تشابه آنتی ژن استفاده می گردد مثل بررسی زیر کلاس های ایمونوگلوبولینی.

نحوه انجام کار در Single Radial Immuno Diffusion

در این روش مقدار معینی از نمونه سرم فرد بیمار را به همراه پروتئین استاندارد در داخل حفره های معین در داخل ژل، می ریزند. همچنین از قبل در داخل ژل، آنتی سرم اختصاصی مونواسپسیفیک ریخته شده است. مثلا اگر قرار باشد IgG فرد یا بیمار اندازه گیری شود، ژل حاوی anti IgG و یا اگر قرار باشد C3 اندازه گیری شود ژل، حاوی antiC3 خواهد بود.
حالا در زمان انکوباسیون با نفوذ نمونه بیمار و نمونه های کنترل از حفره ها به داخل ژل، در محل برخورد با آنتی سرم اختصاصی کمپلکس ها در منطقهEquivalent ، به شکل حلقه سفید رنگ دیده می شوند. حال قطر حلقه های رسوبی مربوط به نمونه بیمار و نمونه استاندارد را می توان با خط کش و بر حسب میلی متر اندازه گیری کرد. با داشتن قطر حلقه های مربوط به نمونه استاندارد و با داشتن غلظت هر یک از آن ها میتوان منحنی استاندارد را رسم  و سپس از روی آن ها، غلظت آنتی ژن مورد نظر را اندازه گیری کرد.

نحوه انجام کار در Double Immuno Diffusion

نحوه انجام کار در این روش به این صورت است که در حفره های تعبیه شده ژل، مقدار معینی آنتی سرم و آنتی ژن نامعلوم ریخته و در طول مدت انکوباسیون بین ۲۴ تا ۴۸ ، آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در داخل ژل نفوذ کرده و در محل برخورد آن ها رسوب سفید رنگ دیده می شود. این هم بهتر است بدانید که در این روش آنتی ژن در حفرات کناری و آنتی سرم در حفره مرکزی ریخته می شود.

مزایا و محدودیت های Immunoprecipitation چیست؟

در ادامه صحبت ها به مزایا و محدودیت های Immunoprecipitation می رسیم. IP  برای غنی سازی کوچک پروتئین ها، ایده آل است و در مقایسه با کروماتوگرافی ترکیبی که زمان بر است، سریع و نسبتاً آسان است. همچنین co-IP در مقایسه با تکنیک های دیگر که تعامل پروتئین-پروتئین را تشخیص می دهند نیز نسبتاً آسان  و با اکثر روش های تجزیه و تحلیل مانند طیف سنجی جرمی سازگار است.

در واقع Co-IP  یک تکنیک قدرتمند برای شناسایی فعل و انفعالات پروتئینی با اهمیت فیزیولوژیکی است؛ بنابراین co-IP  به عنوان روش استاندارد طلایی برای برهم کنش پروتئینی در نظر گرفته می شود. اما co-IP  علیرغم اینکه یک تکنیک قدرتمند برای تجزیه و تحلیل فعل و انفعالات پروتئینی است، ممکن است نتواند تمایلات کم و فعل و انفعالات پروتئینی گذرا را ثبت کند. علاوه بر این ، تعامل پروتئین- پروتئین که توسط co-IP تشخیص داده می شود ممکن است غیر مستقیم باشد، در نتیجه  نتایج حاصل از co-IP باید توسط سنجش های دیگر تأیید شود.

سخن پایانی

(IP) Immunoprecipitation خالص سازی آنتی ژن ها  در مقیاس کوچک و تمایلی است که با استفاده از یک آنتی بادی خاص و یک تکیه گاه جامد مانند ذرات مغناطیسی یا رزین آگارز بی حرکت انجام می شود. این روش  یکی از رایج ترین روش ها برای جداسازی پروتئین ها و سایر مولکول های زیستی از باقی مانده تجزیه سلولی یا بافتی است.