در این مطلب از دایا اکسیر به عنوان برترین سایت فروش مواد شیمیایی آزمایشگاهی به یکی از روش های شناسایی نوکلویک اسیدها و پروتئین ها برای تشخیص اهداف بیولوژیکی در زیست مولکولی، که روش بلاتینگ یا لکه گذاری (Blotting Technique) می باشد پرداخته و در ادامه به تعریف و انواع روش هایی که برای آن وجود دارد، می پردازیم.

بلاتینگ چیست؟

به انتقال مولکول‌های تفکیک شده در الکتروفورز از ژل به روی یک غشا ویژه را بلاتینگ می گویند؛ در این تکنیک به جای استفاده از ژل ها که دارای نفوذپذیری کمی هستند از تفکیک مولکول ها از غشا استفاده می کنند.

روش بلاتینگ ابتدا مخلوطی از مولکول های مورد نظر براساس اندازه مولکولی که ازطریق ژل الکتروفورز عبور کرده است را جدا کرده و سپس مولکول های تفکیکی روی ژل با یک غشا، در حال پرس قرار گرفته و مولکول از داخل ژل به داخل غشا که می تواند جنسی از نیترو سلولز یا پلی وینیلیدن فلوراید و غیره  باشد، با اثر مویینگی انتقال می یابد. بعد از انتقال، پروب های نشانه دار بر روی غشا اضافه می شوند. علت اضافه کردن پروب های نشانه دار، هیبرید شدن آنها با مولکول های مورد نظر است. در نهایت با شستشوی مولکول های هیبرید نشده از مولکول های هیبریداسیون، با مشاهده غشاء توسط پرتوهای آشکارساز X-ray، مولکول ها قابل ردیابی هستند.

انواع روش های بلاتینگ

تکنیک بلاتینگ، روش های متفاوتی را برای انجام کار خود دارد که از مهم ترین آنها می توان به موارد زیر اشاره کرد:

  • Southern blot
  • Northern blot
  • Western blot

در ادامه همراه ما باشید تا نکات مهمی را درخصوص روش های بلاتینگ خدمت شما ارائه دهیم.

آشنایی کامل با Southern blot

 

Southern blot - روش های بلاتینگ - دایا اکسیر | دایا اکسیر

 

ساترن بلات یا بلات جنوبی که از نام مخترع آن ادوارد ساترن گرفته شده است، یک روش آزمایشگاهی برای تشخیص مولکولهای DNA خاص از بین بسیاری از مولکولهای DNA دیگر است. از این تکنیک می توان برای تجزیه و تحلیل کل DNA یک موجود زنده که به عنوان ژنوم آن شناخته می شود، استفاده کرد تا توالی خاص مورد نظر شناسایی شود.

نحوه انجام کار روش Southern blot که اولین روش بلاتینگ می باشد، به این شکل می باشد که در اولین قدم، مخلوط DNA با تجزیه آن به قطعات کوچک با استفاده از پروتئینی به نام آنزیم محدود کننده، تهیه می شود. سپس مخلوط قطعات DNA با توجه به اندازه با استفاده از تکنیکی به نام الکتروفورز ژل جدا می شود. پس از جداسازی، قطعات دو رشته ای DNA در ژل،  یا جدا می شوند یا تغییر شکل می دهند. سپس DNA، از ژل به غشای لکه دار منتقل می شود. بعد از اتمام انتقال، غشا همه نوارهای اصلی را روی ژل حمل می کند و در نهلیت غشاء، با قطعه کوچکی از DNA یا RNA که با پروب هیبریداسیون شده، دارای توالی می باشد که مکمل توالی DNA خاص در نمونه است. در نهایت پس از هیبریداسیون، قطعه DNA مورد نظر از بین بسیاری از قطعات مختلف DNA روی غشا، تشخیص داده می شود.

آشنایی کامل با روش Northern blot

 

Northern blot - روش های بلاتینگ - دایا اکسیر | دایا اکسیر

 

از این روش برای تشخیص مولکولهای RNA خاص در میان مخلوط RNA استفاده می شود و می توان برای تجزیه و تحلیل نمونه ای از RNA از یک بافت یا نوع سلول خاص به منظور اندازه گیری بیان RNA ژن های خاص استفاده کرد.

نحوه انجام کار روش Northern blot به عنوان دومین روش بلاتینگ به این صورت است که ابتدا RNA  درون نمونه که به صورت تک رشته است رنگ کرده یا جدا می کنیم تا رشته ها باز شوند و هیچ پیوندی بین رشته ها وجود نداشته باشد؛ سپس مولکولهای  RNA  را با توجه به اندازه آنها و با استفاده از روش الکتروفورز ژل جدا می کنند.

بعد از جداسازی، RNA  از ژل به غشا منتقل و با پایان یافتن انتقال، همه نوارهای RNA  که روی ژل قرار دارد حمل می ود تا غشاء با پروب مورد نیاز، هیبرید شود تا دنباله مکمل توالی RNA خاص در نمونه یافت شود. در نهایت مولکول RNA مورد نظر از بین بسیاری از مولکولهای RNA مختلف روی غشا، تشخیص داده می شود. همان طور که میدانید روش کار Northern blot شبیه به Southern blot بود.

محدودیتی که این روش بلاتینگ دارد عبارت است از:

برخی از محدودیت های تکنیک بلات شمالی در زیر مورد بحث قرار گرفته است:

  • این روش در مقایسه با روش های RT-PCR و محافظت از نوکلئاز حساسیت کمتری دارد.
  • به مقدار زیادی توالی نمونه RNA هدف نیاز دارد در حالی که تکنیک های جدیدتر مانند زمان واقعی RT-PCR فقط برای تکثیر به یک نسخه RNA نیاز دارند.
  • نسبت به تخریب جزئی نمونه های RNA بسیار حساس است یعنی این عامل به شدت بر کیفیت و کمیت داده ها تأثیر
    می گذارد.
  • در مواردی که نیاز به افزودن چند پروب است، انجام کار سخت می شود و فقط زمانی  پروب اول مامل برداشته شود پروب دوم می تواند، اضافه شود که این عامل باعث می شود انجام کار پیچیده وممکن است پس از تصفیه سیستم با مواد شیمیایی سخت برای برداشتن اولین پروب، صحت داده های دورهای بعدی نیز به خطر بیفتد.
  • فقط می تواند تجمع mRNA حالت پایدار را اندازه گیری کند و ثبات یا رونویسی RNA را اندازه گیری نمی کند.

آشنایی کامل با Western blot

 

Western blot - روش های بلاتینگ - دایا اکسیر

 

این روش برای تشخیص مولکول های پروتئینی خاص از بین مخلوط پروتئین ها بوده  و می تواند شامل تمام پروتئین های مرتبط با بافت یا نوع سلولی خاص باشد. همچنین برای ارزیابی اندازه پروتئین مورد نظر و اندازه گیری میزان آن مورد استفاده قرار گیرد.

اولین قدم در وسترن بلات به عنوان سومین روش بلاتینگ این است که نمونه پروتئین را با مخلوط شوینده ای به نام سدیم دودسیل سولفات مخلوط کنید  چراکه باعث می شود پروتئین ها در زنجیره های خطی، منبسط شوند؛ در مرحله بعد، مولکول های پروتئین با توجه به اندازه آنها و با استفاده از روشی به نام الکتروفورز ژل جدا و پس از جداسازی، پروتئین ها از ژل به غشا منتقل
می شوند.

پس از پایان یافتن انتقال، غشا نیز تمام نوارهای پروتئینی را که روی ژل قرار دارد حمل می کند. در ادامه غشاء با آنتی بادی به نام آنتی بادی اولیه انکوبه می شود که به طور خاص به پروتئین مورد نظر متصل است. در نهایت بعد از انکوباسیون، هر آنتی بادی اولیه غیرمستقیم شسته و غشا مجدداً انکوبه می شود، اما این بار با آنتی بادی ثانویه.  آنتی بادی ثانویه به یک آنزیم پروب که رنگ یا نور تولید می کند، پیوند خورده و اجازه می دهد تا به راحتی شناخته و تصویربرداری شود. در واقع این مرحله است که سبب می شود پروتئین خاصی از میان مخلوطی از پروتئین ها تشخیص داده شود.

سخن پایانی

در این مطلب به تکنیک بلاتینگ (Blotting Technique) به طور کامل پرداخته شد و تمامی روش های انجام این تکنیک نیز مفصلا بیان شد. شما می توانید از مطالب دیگر دایا اکسیر به عنوان برترین مرکز فروش مواد شیمیایی در تهران نیز بهره ببرید.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *