انواع رنگ ها و روش های رنگ آمیزی میکرو ارگانیسم ها

در مطلب قبلی در مورد انواع میکروسکوپ و روش آماده سازی نمونه ها برای مشاهده با میکروسکوپ صحبت کردیم. در این مطلب از دایا اکسیر که فروش مواد شیمیایی آزمایشگاهی را انجام می دهد، می خواهیم انواع رنگ ها و روش های رنگ آمیزی میکرو ارگانیسم ها را بررسی کنیم. برای مشاهده جزئیات سلول ها و ارگانیسم ها، رنگ آمیزی نمونه ها امری ضروری است. رنگ ها و نوع رنگ آمیزی بر اساس خواص شیمیایی رنگ و نمونه مورد مشاهده انتخاب می شوند.

انواع رنگ ها

انواع رنگ ها به ۳ دسته ی بازی ،اسیدی و منفی تقسیم می شوند. این رنگ ها حاوی نمک هایی هستند که از یون مثبت و یون منفی ساخته شده است. بسته به نوع رنگ، یون مثبت یا منفی ممکن است Chromophore  باشد. اگر یون مثبت Chromophore (کروموفور) باشد، رنگ به عنوان یک رنگ basic (بازی) طبقه بندی می شود؛ اگر یون منفی کروموفور باشد، رنگ به عنوان یک رنگ acidic (اسیدی) محسوب می شود.

رنگ های بازی یا هسته ای اصولا یا DNA و یا RNA یاخته ترکیب می شوند. از انواع رنگ های بازی می توان کریستال ویوله , فوشین ,آبی متیلن و سبز متیل را نام برد.کریستال ویوله که بار الکتریکی مثبت دارد به وسیله باکتری دارای بار الکتریکی منفی جذب می شود و آن را رنگ می کند. رنگ های اسیدی شامل سافرانین و فوشین اسیدی و قرمز کنگو هستند و ترکیبات بازی یاخته و اصولاٌ پروتئین های بازی را رنگ می کنند.

از آنجایی که سلول‌ها معمولاً دارای دیواره‌های سلولی با بار منفی هستند، کروموفورهای مثبت موجود در رنگ‌های بازی به دیواره‌های سلولی می‌چسبند و باعث ایجاد رنگ های مثبت می‌شوند. بنابراین، رنگ‌های اساسی که معمولاً مورد استفاده قرار می‌گیرند مانند فوشین ، کریستال ویوله، مالاشیت گرین، متیلن بلو و سافرانین معمولاً به عنوان رنگ های مثبت عمل می‌کنند. از سوی دیگر، کروموفورهای دارای بار منفی در رنگ‌های اسیدی توسط دیواره‌های سلولی با بار منفی دفع می‌شوند و باعث ایجاد رنگ های منفی می‌شوند. رنگهای اسیدی رایج شامل فوشین اسید، ائوزین و رز بنگال است.

خرید رنگ های آزمایشگاهی از برند مرک

انواع رنگ آمیزی

• رنگ آمیزی ساده
• رنگ آمیزی افتراقی یا مرکب

رنگ آمیزی ساده

برخی از تکنیک های رنگ آمیزی شامل اعمال تنها یک رنگ بر روی نمونه است. بقیه به بیش از یک رنگ نیاز دارند. در رنگ‌آمیزی ساده، از یک رنگ برای تأکید بر ساختارهای خاص در نمونه استفاده می‌شود.

یک رنگ ساده به طور کلی باعث می شود همه موجودات موجود در نمونه یک رنگ به نظر برسند، حتی اگر نمونه حاوی بیش از یک نوع ارگانیسم باشد. در مقابل، رنگ‌آمیزی افتراقی یا مرکب موجودات زنده را بر اساس برهمکنش آنها با چندین رنگ متمایز می‌کند. به عبارت دیگر، دو موجود زنده در یک نمونه رنگ‌آمیزی رنگ‌های متفاوتی داشته باشند. انواع رنگ آمیزی افتراقی شامل رنگ‌آمیزی گرم، رنگ‌آمیزی اسید فست، رنگ‌آمیزی اندوسپور، رنگ‌آمیزی تاژک‌ها و رنگ‌آمیزی کپسولی است.

رنگ آمیزی افتراقی یا مرکب

رنگ آمیزی گرم

یکی از روش های رنگ آمیزی مرکب، رنگ آمیزی گرم می باشد.در این رنگ‌آمیزی، باکتری‌ها بر مبنای رنگ باکتری؛ پس از رنگ‌آمیزی، به دو دستهی گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند. رنگ باکتری پس از رنگ‌آمیزی به توانایی باکتری در حفظ رنگ؛ و به عبارتی به ساختمان دیوارهی سلولی آن باکتری بستگی دارد. در رنگ‌آمیزی گرم باکتری‌های گرم مثبت پس از رنگ‌آمیزی به رنگ بنفش و باکتری‌های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می‌شوند. هر دو گروه یعنی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی دارای دیواره هستند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به ویژگی‌هایی است که در ساختمان دیواره سلولی آن‌ها وجود دارد. اساس ساختمان در دیوارهی سلولی باکتری‌های گرم مثبت لایهی ضخیمی (۵۰ تا %۹۰ دیواره) از پپتیدوگلیکان است، ولی در باکتری‌های گرم منفی ضخامت آن به حداقل، (%۱٠ دیواره) می‌رسد.

روش رنگ آمیزی گرم یک روش رنگ آمیزی افتراقی است که شامل چندین مرحله است. این روش توسط میکروبیولوژیست دانمارکی هانس کریستین گرام در سال ۱۸۸۴ به عنوان روشی موثر برای تمایز بین باکتری ها با انواع مختلف دیواره های سلولی ایجاد شد و حتی امروزه نیز یکی از پرکاربردترین تکنیک های رنگ آمیزی باقی مانده است.

مراحل رنگ آمیزی گرم

ابتدا، کریستال ویوله، یک رنگ اولیه، روی یک اسمیر ثابت شده با حرارت اعمال می شود و به همه سلول ها رنگ بنفش می دهد.

در مرحله بعد، ید اضافه می شود که برای ایجاد یا تثبیت رنگ ها استفاده می شود. در این مورد، ید مانند یک عامل به دام انداختن عمل می‌کند که با کریستال ویوله کمپلکس می‌شود، و باعث می‌شود کمپلکس کریستال ویوله-ید در لایه‌های ضخیم پپتیدوگلیکان در دیواره‌های سلولی باقی بماند.

سپس، یک عامل رنگ‌زدایی، مثل اتانول یا محلول استون/اتانول اضافه می‌شود. سلول‌هایی که دارای لایه‌های پپتیدوگلیکان ضخیم در دیواره‌های سلولی خود هستند، بسیار کمتر تحت تأثیر عامل رنگ‌زدایی قرار می‌گیرند. آنها به طور کلی رنگ بنفش کریستالی را حفظ می کنند و بنفش باقی می مانند. با این حال، عامل رنگ‌زدایی به راحتی رنگ را با لایه‌های پپتیدوگلیکان نازک‌تر از سلول‌ها می‌شوید و دوباره آنها را بی‌رنگ می‌کند.

در نهایت، یک رنگ ثانویه، معمولا سافرانین، اضافه می شود. این رنگ سلول‌های رنگ‌زدایی شده را صورتی یا قرمز رنگ می‌کند.

سلول های بنفش رنگ که با کریستال ویوله رنگ آمیزی شده اند به عنوان باکتری های گرم مثبت و سلول های صورتی یا قرمز رنگ که با سافرانین رنگ شده اند به عنوان باکتری های گرم منفی شناخته می شوند.

چندین نکته مهم در تفسیر نتایج رنگ آمیزی گرم وجود دارد. اول، سلول‌های باکتریایی مسن‌تر ممکن است در دیواره‌های سلولی خود دچار آسیب شده باشند که باعث می‌شود بعد از رنگ آمیزی ، حتی اگر گونه گرم مثبت باشد،گرم منفی به نظر برسد. بنابراین بهتر است از کشت های تازه باکتریایی برای رنگ آمیزی گرم استفاده شود. ثانیاً، خطاهایی مانند ماندن رنگ‌زدایی بیش از حد طولانی مدت می‌تواند بر نتایج تأثیر بگذارد.

در برخی موارد، بیشتر سلول‌ها گرم مثبت و تعداد کمی گرم منفی به نظر می‌رسند. این نشان دهنده آسیب به سلول ها است یا اینکه رنگ زدا برای مدت طولانی روی نمونه باقی مانده است. اگر سلول‌ها همگی یک گونه باشند و نه کشت مخلوط، باید همچنان به عنوان گرم مثبت طبقه‌بندی شوند.

حرارت بیش از اندازه هنگام تثبیت گسترش نیز باعث پاره شدن دیوارهی سلولی باکتری شده؛ بنابراین باکتری گرم مثبت رنگ کریستال ویوله را هنگام رنگ زدایی از دست می‌دهد و رنگ ثانویه را جذب می‌کند و در نتیجه باکتری گرم مثبت، به صورت گرم منفی دیده می‌شود. همچنین اگر گسترش ضخیم باشد هنگام مرحلهی بی‌رنگ شدن، ممکن است مانند یک گسترش معمولی رنگ نشود و این مسئله می‌تواند باعث خطا در تشخیص در گرم منفی یا مثبت بودن باکتری شود.

علاوه بر برهمکنش‌های متفاوت آنها با رنگ‌ها و عوامل رنگ‌زدا، تفاوت‌های شیمیایی بین سلول‌های گرم مثبت و گرم منفی، پیامدهای دیگری نیز در ارتباط بالینی دارند. برای مثال، رنگ‌آمیزی گرم می‌تواند به پزشکان کمک کند تا پاتوژن‌های باکتریایی را در یک نمونه به دسته‌هایی مرتبط با ویژگی‌های خاص طبقه‌بندی کنند و با شناسایی جنس باکتری آنتی‌بیوتیک مناسب را انتخاب کنند.باکتری های گرم منفی نسبت به باکتری های گرم مثبت نسبت به آنتی بیوتیک های خاص مقاومت بیشتری دارند.

سخن پایانی

در این مطلب به موضوع انواع رنگ ها و روش های رنگ آمیزی میکرو ارگانیسم ها پرداخته شد.در مطالب بعدی روش های رنگ  آمیزی مختلف را با جزئیات مورد بررسی قرار خواهیم داد.