در مطلب قبلی در مورد آنالیز SDS-PAGE صحبت کردیم. در این مطلب از دایا اکسیر که فروش مواد شیمیایی آزمایشگاهی را انجام میدهد، می خواهیم به بررسی میکروسکوپ ها و روش آماده سازی نمونه برای مشاهده با میکروسکوپ بپردازیم. بررسی نمونه های مختلف با میکروسکوپ از رایج ترین نیازها در آزمایشگاه ها می باشد که به این منظور لازم است نمونه ها آماده سازی شوند.
انواع میکروسکوپ
میکروسکوپ ها انواع مختلفی دارند که از رایج ترین انواع مورد استفاده آن میتوان به میکروسکوپ نوری و الکترونی اشاره کرد. بیشتر میکروسکوپهای دانشجویی در گروه میکروسکوپهای نوری طبقه‌بندی می‌شوند.
میکروسکوپ نوری
در میکروسکوپ نوری، نور مرئی از داخل نمونه (نمونه بیولوژیکی) عبور می‌کند و از طریق سیستم لنز شکسته می‌شود و به کاربر امکان میدهد تا تصویر را با بزرگنمایی مشاهده کند. میکروسکوپهای نوری ساده با یک لنز می‌توانند نمونه را تا ۳۰۰ برابر بزرگنمایی کنند و به همین دلیل با این میکروسکوپ‌ها قادر به دیدن برخی از باکتری‌ها هستیم، در حالی که میکروسکوپهای نوری مرکب می‌توانند نمونه را تا ۲۰۰۰ برابر بزرگنمایی کنند. میکروسکوپ نوری ساده می‌تواند زیر ۱ میکرومتر قدرت تفکیک داشته باشد، در حالی که قدرت تفکیک و وضوح میکروسکوپ مرکب ممکن است تا حدود ۰٫۲ میکرومتر باشد .میزان قدرت تفکیک هر میکروسکوپ با کاهش طول موج نوری آن افزایش می‌یابد.
فواید میکروسکوپ نوری
فایده میکروسکوپ نوری این است که اغلب به منظور مشاهده سلول‌های زنده قابل استفاده است، بنابراین میتوان رفتار سلول‌های زنده مانند حرکت یا تقسیم سلولی، بافت‌های زنده مختلف بدن، اندامک‌ها و اجزا مختلف باکتری‌ها را زیر میکروسکوپهای نوری مشاهده کرد. استفاده از میکروسکوپهای نوری آسان است و پیچیدگی‌ها کار با سایر میکروسکوپ‌ها مانند میکروسکوپهای الکترونی را ندارد و علاوه بر این، هزینه کار و نگهداری از این میکروسکوپ‌ها به مراتب کمتر است.
میکروسکوپ های الکترونی
میکروسکوپ های الکترونی انواع دیگری از میکروسکوپ‌ها هستند که از الکترونها به جای نور مرئی استفاده می‌کنند و از پرتو الکترونها در شکل‌گیری تصویر اجسام استفاده می‌کند. الکترونها از طول موج بسیار کوتاه‌تری نسبت به نور مرئی برخوردار هستند و این به میکروسکوپهای الکترونی اجازه میدهد تا تصاویری با وضوح بالاتر نسبت به میکروسکوپهای نوری استاندارد تولید کنند. میکروسکوپهای الکترونی می‌توانند برای بررسی نه تنها سلول‌های کامل، بلکه ساختارهای درون سلول و اندامک‌های درون آنها نیز مورد استفاده قرار گیرند.
میکروسکوپهای الکترونی از نظر منبع نوری با میکروسکوپهای نوری متفاوت هستند زیرا با استفاده از پرتو الکترونها به جای پرتو نور، تصویری از یک نمونه تولید می‌کنند. برای عبور پرتوهای الکترونی، ستون‌های نوری این میکروسکوپ‌ها دارای سیستم خلا هستند، زیرا پرتوهای الکترونی در حضور سایر مولکول‌ها پایداری خود را از دست می‌دهند و می‌توانند با مولکول‌های گازی محیط وارد واکنش شوند، از این رو وجود خلا در مسیر عبور پرتوهای الکترونی موجب جلوگیری از هر گونه انحراف، افزایش قدرت تفکیک و مشاهده جزئیات بیشتر نمونه می‌شود.
آماده سازی نمونه ها با میکروسکوپ
در محیط های بالینی و تحقیقاتی، میکروسکوپ های نوری رایج ترین میکروسکوپ های مورد استفاده هستند به همین منظور به بررسی آماده سازی نمونه برای این نوع میکروسکوپ ها می پردازیم. دو نوع اصلی آماده سازی برای مشاهده نمونه ها با میکروسکوپ نوری وجود دارد:
- آماده سازی نمونه های بر پایه رطوبت( wet mounts)
- آماده سازی نمونه هایی تثبیت شده (fixed specimens)
آماده سازی نمونه های بر پایه رطوبت
ساده ترین نوع آماده سازی، نمونه های مرطوب است که در آن نمونه بر روی یک قطره مایع روی لام قرار می گیرد. برخی از نمونه ها، مانند یک قطره ادرار، قبلاً به شکل مایع هستند و می توانند با استفاده از قطره چکان روی لام قرار گیرند. نمونه های جامد، مانند تکه ای پوست، را می توان با از افزودن یک قطره مایع برای آماده سازی پایه مرطوب، روی لام قرار داد. گاهی اوقات مایع مورد استفاده فقط آب است، اما اغلب رنگ هایی برای افزایش کنتراست نیز اضافه می شود و هنگامی که مایع به لام اضافه شد، یک ورقه پوششی در بالای آن قرار داده می شود(لامل) و نمونه برای بررسی زیر میکروسکوپ آماده است.
آماده سازی نمونه هایی تثبیت شده
روش دوم آماده سازی نمونه ها برای میکروسکوپ نوری تثبیت (Fixation) است. “تثبیت” یک نمونه به فرآیند اتصال سلول ها به یک اسلاید اشاره دارد. تثبیت اغلب یا با حرارت دادن (تثبیت حرارتی) یا عملیات شیمیایی نمونه حاصل می شود. علاوه بر اتصال نمونه به لام، تثبیت، میکروارگانیسم های موجود در نمونه را نیز از بین می برد، حرکت و متابولیسم آنها را متوقف می کند و در عین حال یکپارچگی اجزای سلولی آنها را برای مشاهده حفظ می کند. برای تثبیت حرارتی یک نمونه، یک لایه نازک از نمونه روی لام پخش می‌شود (به نام اسمیر) و سپس لام برای مدت کوتاهی روی یک منبع حرارتی گرم می‌شود. تثبیت کننده های شیمیایی اغلب برای نمونه های بافتی به حرارت ترجیح داده می شوند.
عوامل شیمیایی مانند اسید استیک، اتانول، متانول، فرمالدئید (فرمالین) و گلوتارآلدئید می توانند پروتئین ها را دناتوره کنند، واکنش های بیوشیمیایی را متوقف کنند و ساختار سلولی را در نمونه های بافتی تثبیت کنند. مرحله بعد از تثبیت، رنگ آمیزی می باشد که تقریباً همیشه برای رنگ آمیزی ویژگی های خاصی از نمونه، قبل از بررسی آن در زیر میکروسکوپ نوری اعمال می شود و سپس نمونه را برای بررسی و قرارگیری زیر میکروسکوپ آماده است.در مطلب بعدی به موضوع انواع رنگ آمیزی و روش های انجام آن خواهیم پرداخت.
سخن پایانی
در این مطلب به موضوع آماده سازی نمونه ها روی لام برای مشاهده با میکروسکوپ پرداخته شد. روش‌های متعددی برای شناسایی میکروب‌های خاص، ساختارهای سلولی، توالی‌های DNA یا شاخص‌های عفونت در نمونه‌های بافتی، در زیر میکروسکوپ ایجاد شده‌اند. این امرتشخیص ساختارهای مهم سلولی را ممکن می کند.
