در مطلب قبلی در مورد آنالیز طیف سنجی مرئی-فرابنفش (uv-vis) صحبت کردیم. در این مطلب از دایا اکسیر که فروش مواد شیمیایی آزمایشگاهی را انجام میدهد، می خواهیم در خصوص تکنیک فلوسایتومتری (Flow cytometry) که سلول های موجود در مایعات بیولوژیک بدن مانند خون را شناسایی میکند، صحبت کنیم. در ادامه بیشتر درباره فلوسایتومتری صحبت خواهیم کرد.

فلوسایتومتری چیست؟

فلوسایتومتری (Flow cytometry) چیست؟ | دایا اکسیر

فلوسایتومتری (Flow cytometry)، تکنیکی است که سلولی‌های موجود در مایعات بیولوژیک بدن مانند خون، مایع مغزی نخاعی، سایر ترشحات و سلول‌ های نسجی به شکل سوسپانسیون، با استفاده از آنتی بادی‌ های اختصاصی و تابش نور لیزر شناسایی می‌شوند. در ادامه بیشتر به توضیح این تکنیک می پردازیم.
هر ذره برای پراکندگی نور مرئی با یک یا چند پارامتر فلورسانس تجزیه و تحلیل می شود؛ همچنین پراکندگی نور مرئی در دو جهت مختلف اندازه گیری می گردد یکی Forward Scatter (جهت رو به جلو) یا FSC که می تواند اندازه نسبی سلول را نشان دهد و دیگری Side Scatter(جهت ۹۰ درجه) یا SSC که نشان دهنده پیچیدگی داخلی یا ساختار گرانولی سلول است.
همچنین این هم بدانید که پراکندگی نور، مستقل از فلورسانس است و نمونه‌ها برای اندازه‌گیری فلورسانس از طریق ترانسفکشن و بیان پروتئین‌های فلورسنت مثلاً پروتئین فلورسنت سبز، GFP، رنگ‌آمیزی با رنگ‌های فلورسنت (مانند پروپیدیوم یدید، DNA) یا رنگ‌آمیزی با آنتی‌بادی‌های کونژوگه فلورسنت مانند CD3 FITC، آماده می‌شوند.
بنابراین فلوسایتومتری ابزار قدرتمندی است که در رشته های مختلفی مانند ایمونولوژی، ویروس شناسی، زیست شناسی مولکولی، بیولوژی سرطان و کنترل بیماری های عفونی کاربرد دارد.
به عنوان مثال برای مطالعه سیستم ایمنی و پاسخ آن به بیماری های عفونی و سرطان کمک بسیاری می کند و این امکان را برای شناسایی مخلوط های سلولی از خون، مغز استخوان و همچنین بافت های جامد که می توانند به سلول های منفرد مانند غدد لنفاوی، طحال، بافت های مخاطی، تومورهای جامد و غیره تجزیه شوند را فراهم می آورد. علاوه بر تجزیه و تحلیل جمعیت سلول ها یک کاربرد اصلی فلوسایتومتری، مرتب سازی سلول ها برای تجزیه و تحلیل بیشتر است.
افزایش معرف های موجود در چند سال گذشته منجر به رشد زیاد در تعداد پارامترهای مورد استفاده در آزمایشات فلوسایتومتری شد همچنین فلوئوروکروم های مورد استفاده برای ترکیب آنتی بادی های مونوکلونال افزایش چشمگیری پیدا کردند.

Flow cytometry (فلوسایتومتری) چگونه کار می کند؟

برای شروع فلوسایتومتری اولین گام، آماده سازی نمونه برای تجزیه و تحلیل است. سلول‌های به‌دست‌آمده از کشت سلولی، خون، یا بافت‌های متلاشی‌شده باید به‌صورت سوسپانسیون آماده شوند. این سوسپانسیون سلولی برای رنگ آمیزی در چندین لوله تقسیم می شود(مقداری از سلول های رنگ آمیزی نشده به عنوان کنترل حفظ می شوند). نمونه‌های دیگر با افزودن آنتی‌بادی‌هایی نشان شده با پروب‌های فلورسنت یا رنگ‌هایی که اجزای سلولی را رنگ می‌کنند، رنگ‌آمیزی می‌شوند. هنگام تجزیه و تحلیل پروتئین های داخل سلولی، ابتدا سلول ها باید در بافر فرمالین ثابت(fix) و با یک معرف مناسب نفوذپذیر شوند تا آنتی بادی ها و رنگ ها وارد سلول شوند. پس از انکوباسیون با آنتی‌بادی‌ها یا رنگ‌ها، سلول‌ها در بافر شسته می‌شوند و برای تجزیه و تحلیل در یک بافر مبتنی بر نمک معلق می‌شوند. این نمونه آماده شده سپس به فلوسایتومتر معرفی می شود.

اجزای اصلی فلوسایتومتر

اجزای اصلی فلوسایتومتر | دایا اکسیر

• Fluidics

سیستم حاوی مایع غلاف (یک بافر مبتنی بر نمک یا آب) که تحت فشار از طریق دستگاه برای هدایت نمونه سلول گذشته از لیزر، جهت اندازه گیری جداگانه از هر سلول منفرد است

• اپتیک

شامل لیزرهایی است که نور را به نمونه‌ها ساطع می‌کند تا اپتیک‌هایی مانند لوله‌های مولتی‌پلیر نوری (PMT)، سیگنال پراکنده شده توسط نمونه را جمع‌آوری کند.

• الکترونیک سیتومتر

سیگنال شناسایی شده را به پارامترهای دیجیتال تبدیل می کند که اینکار با استفاده از نرم افزار، قابل تجزیه و تحلیل هستند.

کاربردهای Flow cytometry (فلوسایتومتری) چیست؟

فلوسایتومتری در بیولوژی سلولی و کاربردهای بالینی مورد استفاده قرار میگیرد که از کاربردهای زیست شناسی سلولی آن میتوان به موارد زیر اشاره کرد.

  • شمارش سلولی
  • تجزیه و تحلیل چرخه سلولی
  • اندازه گیری viability
  • تکثیر
  • فنوتایپ انواع مختلف سلول و مرتب سازی سلول

برای کاربردهای بالینی نیز در موارد زیر می توان از فلوسایتومتری استفاده کرد:

  • شناسایی سلول های ایمنی مختلف
  • ارزیابی تولید سایتوکین پس از فعال شدن سلول های ایمنی و واکنش بالقوه آنها نسبت به سلول های هدف
  • مطالعه سلول های سرطانیو سلول ها در ریزمحیط ها به طور عمیق
  • شناسایی سلول های آلوده به ویروس
  • ارزیابی ویژگی‌های اسپرم در آنالیزهای باروری
  • نظارت بر بیماری قلبی و سپسیس
  • مشخص کردن سلول‌ها در تحقیقات علوم اعصاب

چالش ها و محدودیت های فلوسایتومتری

علیرغم مزایایی که فلوسایتومتری می تواند برای بیولوژی سلولی و کاربردهای بالینی ارائه دهد، برخی از جنبه های منفی مرتبط با این تکنیک نیز وجود دارد. به عنوان مثال ثابت ماندن سیالات در سیستم می تواند چالش برانگیز باشد، زیرا سلول ها یا زباله ها باعث مسدود شدن یا تغییر در نرخ جریان می شوند که بر تجزیه و تحلیل تأثیر می گذارد و هنگامی که سلول های بزرگتر مانند سلول های سرطانی تجزیه و تحلیل شوند، خطر این مشکل بیشتر وجود دارد
یکی دیگر از محدودیت های این تکنیک، آلودگی در لوله کشی است که می تواند باعث مسدود شدن سیستم و قطع جریان شود. همچنین تراز لیزری نیز برای اطمینان از نتایج ثابت ضروری است و باید به طور منظم بررسی شود.
محدودیت‌های دیگر شامل پتانسیل سیتومتر برای آسیب رساندن به سلول‌ها، تأثیر بر آنالیز و کشت بعدی هنگام مرتب‌سازی سلول‌ها، و ناتوانی آنالیز تک سلولی برای ارائه اطلاعات در مورد ویژگی‌های بافت است.

سخن پایانی

در این مطلب به موضوع اینکه فلوسایتومتری چیست، چگونه کار می‌کند و چه کاربردی دارد، پرداخته شد و باتوجه به مطالب که تاکنون گفته شد میتوان نتیجه گرفت از تکنیک فلوسایتومتری، روشی دقیق با کارایی بالا برای شناسایی و ارزیابی ویژگی های سلول ها است که بر اساس پراکنده سازی نور توسط سلول‌های مورد آزمایش و انتشار فلورسانس از آنها صورت می گیرد.

 

7 دیدگاه در فلوسایتومتری (Flow cytometry) چیست و چگونه کار می کند؟

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.